Scoperta di due nuove isoforme del gene umano DUT

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 7760 (2023) Citare questo articolo

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Nelle cellule umane sono state descritte due isoforme di dUTPasi: una nucleare (DUT-N) e una mitocondriale (DUT-M), con segnali di localizzazione affini. Al contrario, qui abbiamo identificato due isoforme aggiuntive; DUT-3 senza alcun segnale di localizzazione e DUT-4 con lo stesso segnale di localizzazione nucleare di DUT-N. Sulla base di un metodo RT-qPCR per la quantificazione simultanea specifica dell'isoforma, abbiamo analizzato i relativi modelli di espressione in 20 linee cellulari umane di origini molto diverse. Abbiamo scoperto che l'isoforma DUT-N è espressa di gran lunga al livello più alto, seguita dall'isoforma DUT-M e DUT-3. Una forte correlazione tra i livelli di espressione di DUT-M e DUT-3 suggerisce che queste due isoforme potrebbero condividere lo stesso promotore. Abbiamo analizzato l'effetto della carenza di siero sull'espressione delle isoforme di dUTPasi rispetto alle cellule non trattate e abbiamo scoperto che i livelli di mRNA di DUT-N diminuivano nelle cellule A-549 e MDA-MB-231, ma non nelle cellule HeLa. Sorprendentemente, dopo la carenza di siero DUT-M e DUT-3 hanno mostrato un aumento significativo nell'espressione, mentre il livello di espressione dell'isoforma DUT-4 non ha mostrato alcun cambiamento. Nel loro insieme i nostri risultati indicano che la fornitura di dUTPasi cellulare può anche essere fornita nel citoplasma e che i cambiamenti di espressione indotti dallo stress da fame dipendono dalla linea cellulare.

Le polimerasi non sono in grado di distinguere tra dUTP e dTTP poiché differiscono solo per un gruppo metilico, pertanto mantenere il rapporto dUTP/dTTP appropriato è della massima importanza1. L'enzima dUTPasi è responsabile della preservazione dell'integrità del genoma catalizzando l'idrolisi del dUTP in dUMP e pirofosfato, eliminando così il dUTP dal pool dNTP2,3. Se il dUTP è disponibile, l'uracile incorporato viene scisso dalle glicosilasi uracile-DNA come parte del meccanismo di riparazione dell'escissione della base4. Un livello elevato di dUTP può portare alla morte delle cellule senza timo attraverso l'iperattivazione del processo di riparazione del DNA5; per evitare ciò è necessaria l'attività dell'enzima dUTPasi. L'altro ruolo della reazione catalizzata dalla dUTPasi è quello di produrre dUMP, che è un substrato per la timidilato sintasi nella via di sintesi de novo del dTTP.

Ad oggi, in letteratura sono state descritte due isoforme di dUTPasi umana, che si localizzano rispettivamente nel nucleo e nel mitocondrio, presumibilmente per garantire la regolazione del pool di dUTP in questi due organelli contenenti DNA6. Le due isoforme sono codificate dal gene DUT e generate mediante l'utilizzo di promotori alternativi accoppiati con splicing alternativo7,8. Le due isoforme differiscono solo nel primo esone, poiché l'isoforma mitocondriale (DUT-M) contiene una sequenza di targeting mitocondriale, mentre l'isoforma nucleare (DUT-N) contiene un segnale di localizzazione nucleare7,9,10. Le due isoforme di dUTPasi sono state descritte da Ladner et al. con analisi Northern e Western Blot rispettivamente a livello di mRNA e proteine7. I livelli di espressione dell'RNA delle isoforme nelle cellule di fibroblasti polmonari umani 34Lu sono stati studiati anche in condizioni di carenza di siero, che costringe le cellule a uscire dal ciclo cellulare ed entrare in uno stato di riposo. Secondo Ladner et al., questa transizione porta ad una drastica diminuzione dell'espressione dell'isoforma DUT-N dUTPasi, senza alcun cambiamento nel livello dell'isoforma DUT-M.

Recenti studi di sequenziamento ad alto rendimento hanno previsto la presunta presenza di due isoforme aggiuntive negli esseri umani, definite DUT-3 (ID UniProt: A0A0C4DGL3, ID NCBI RefSeq: NM_001025249.1) e DUT-4 (ID UniProt: H0YNW5, ID NCBI RefSeq: NM_001330286.2) nel presente lavoro. I database di sequenze suggeriscono che la terza isoforma suggerita (DUT-3) non contiene alcun segnale di localizzazione, quindi molto probabilmente è trattenuta nel citosol. La parte a monte della regione 5' UTR del DUT-3 è identica a quella del DUT-M, tuttavia, la sequenza leader mitocondriale, presente nel primo esone dell'isoforma DUT-M, è assente dall'isoforma DUT-3. Si prevedeva che la quarta isoforma suggerita (DUT-4) somigliasse molto all'isoforma DUT-N, differendo solo per alcuni amminoacidi all'N-terminale. Il primo esone di questa isoforma è situato a monte delle altre isoforme nel genoma, pertanto la sua espressione potrebbe essere guidata da un promotore alternativo per una potenziale regolazione alterata di questa isoforma. Non sono stati ancora riportati dati sui livelli di espressione fisiologica o sui ruoli di queste due nuove isoforme di dUTPasi umana.